ELECTROPHORESE CAPILLAIRE EN PRATIQUE POUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES DANS LE DOMAINE PHARMACEUTIQUE
Biotechnologies
Objectifs
Présenter les principes, l'instrumentation et les applications de l'électrophorèse capillaire à la caractérisation d’acides aminés, protéines et anticorps, oligonucléotides
Contenu pédagogique
THEORIE
- Généralités sur les techniques électrocinétiques
De l’électrophorèse capillaire de zone à la chromatographie électrocinétique.
Les Phénomènes de transport : migration électrophorétique et écoulement électroosmotique Aspects instrumentaux
Modes de détection (UV-Vis, Fluorescence induite par laser LIF, conductimétrie, spectrométrie de masse)
Analyse quantitative : les modes d’injection, de préconcentration et de quantification
- Les modes de séparations électrocinétiques pour l’analyse des molécules biologiques
Electrophorèse capillaire de zone en milieu libre
Séparation des acides aminés et peptides
Spécificités liées à l’analyse des protéines
Caractérisation de la glycosylation des anticorps : séparation par électrophorèse capillaire couplée à la détection par fluorescence induite par laser LIF après clivage et dérivation
Exemples de séparation
- Chromatographie électrocinétique capillaire
Séparation de peptides ou d’acides aminés dérivés en chromatographie électrocinétique micellaire, séparations chirales en présence de pseudo-phases stationnaires chirales
- Electrophorèse capillaire sur gel
Séparation des protéines, anticorps et des oligonucléotides en fonction de leur taille, détermination des masses moléculaires, de la pureté
- Focalisation isoélectrique
Séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique
TRAVAUX PRATIQUES AU LABORATOIRE
- Electrophorèse capillaire de zone
Influence des principaux paramètres expérimentaux: pH de l’électrolyte, force ionique de l’électrolyte, température, tension appliquée. Mesure des temps de migration et des efficacités de séparation – Calculs des mobilités électroosmotique – Ordre de migration
- Séparation sur gel
Caractérisation des anticorps monoclonaux et de leurs fragments en fonction de leur taille (électrophorèse sur gel en milieu dénaturant avec détection UV)- détermination de la masse moléculaire de protéines, d’oligonucléotides
- Focalisation isoélectrique capillaire
Séparation de protéines en fonction de leur point isoélectrique – influence du gradient de pH
- Chromatographie électrocinétique
Séparations de peptides en chromatographie électrocinétique micellaire. Séparations chirales en présence de pseudo phases stationnaires chirales.