ELECTROPHORESE DES PROTEINES EN GEL DE POLYACRYLAMIDE EN PRÉSENCE DE SDS (SDS-PAGE) – ANALYSE DES PROTÉINES PAR « WESTERN BLOT » APRÈS SDS-PAGE
Biotechnologies
Objectifs
Connaître les principes de base et la mise en œuvre des techniques de séparation des protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS et de la révélation spécifique de certaines d’entre elles par «Western Blot ».
Contenu pédagogique
THÉORIE
Rappel sur la structure des protéines
Rôle des acides aminés, de la liaison peptidique, de la liaison hydrogène, des interactions hydrophobes, des interactions ioniques, des modifications post-traductionnelles dans la structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire des protéines
Notions de poids et de masse moléculaire, ainsi que de charge électrique à un pH donné et de pHi
Les conditions de solubilisation des protéines en préalable à leur analyse
Rôle du pH, des détergents ioniques, non ioniques, des zwitterrions ; rôle de l’urée
Principes de la séparation des protéines par électrophorèse
L’électrophorèse des protéines en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE)
Les conditions de l’électrophorèse – Les paramètres électriques
Révélation et identification des protéines
(différentes méthodes de coloration y compris la coloration à l’argent)
Principe du transfert des protéines pour le « western blot » (WB)
Méthodes de transfert des protéines sur membrane après SDS-PAGE
Méthodes de révélation et d’identification des protéines d’intérêt
Questions/réponses à des problèmes concrets
TRAVAUX PRATIQUES
Découverte de la méthodologie et des appareils – Démonstration de la procédure
Préparation des tampons, des solutions et des réactifs
Préparation et polymérisation des gels de polyacrylamide
Dépôt des échantillons
Séparation des protéines par SDS-PAGE
Coloration des protéines au bleu de Coomassie
Coloration des protéines à l’argent
Transfert des protéines sur membrane après séparation par électrophorèse
Révélation des protéines séparées par SDS-PAGE et transférées sur membrane (WB)
Questions/réponses à des problèmes concrets